МУК 4.2.1773-03 Метод микробиологического измерения концентрации клеток Candida tropicalis Y-456 - продуцента ксилита в атмосферном воздухе населенных мест

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации,
Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

24 октября 2003 г.

Дата введения: 1 декабря 2003 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации

клеток Candida tropicalis Y-456 - продуцента ксилита
в атмосферном воздухе населенных мест
Методические указания
МУК 4.2.1773-03

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Candida tropicalis Y-456 - продуцента ксилита в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м3 воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2. Биологическая характеристика Candida tropicalis Y-456 и его гигиенический норматив

На сусло-агаре на 2-3 сутки штамм образует круглые кремоватые колонии с ровным краем, средний диаметр изолированных колоний составляет 0,3 см, а максимальный - 0,8 см. В центре колоний образуется небольшое возвышение - «бугорок», на среде появляется маленькое желто-оранжевое окрашивание. Консистенция колоний мягкая, неплотная, вязкая. Поверхность гладкая, слегка матовая.

Морфологически штамм представлен полиморфными клетками: округлые, овальные, большей частью одиночные 2-4 мкм, иногда цепочки или конгломераты из вытянутых клеток 10-12 мкм. Наблюдается обилие бластоспор.

При выращивании на кукурузном агаре по Дальмау в чашках Петри обильно образуются псевдогифы с многократными разветвлениями и бластоконидиями, расположенными одиночно или цепочками вдоль гиф (8).

Систематическое положение микроорганизма

Класс

Fungi imperfecti

Порядок

Blastomycetales

Род

Candida

Вид

tropicalis

Штамм

Y-456

Штамм получен из ЦМПМ ВНИИгенетика как продуцент этанола и селектирован по признаку формирования крупных колоний на средах с ксилозой. Штамм является продуцентом ксилита. Продуктивность на средах с 5 % содержанием ксилозы: максимальная -80 % ксилита, средняя - 78,8-76,2 % (39,5 г/л) ксилита.

Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Оптимальная температура роста 35-37 °С, рН среды - 5,0-6,0. Для размножения используется сусло-агар 5-6°Б, среда ДАП - глюкоза (ксилоза) - 20 г, дрожжевой экстракт - 2,0 г, пептон - 2 г, агар-агар -20 г, вода - 1 л, рН среды - 5,0-6,0.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 30 кл/м3, пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток дрожжевого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток дрожжеподобного гриба на поверхность среды сусло-агар и подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на 2 сутки развития. В качестве дополнительного контроля предлагается отбор пробы на чашку Петри с селективной средой для дифференцирования С. tropicalis от других дрожжеподобных грибов, обладающих способностью к образованию ростковых трубок (9,10).

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818(щелевой прибор Кротова)

ТУ 64-12791-77

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический

ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением ×10

ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100мм

Пробирки биологические, вместимостью20 и 35 мл

Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл

Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл

ГОСТ 10515-75

ГОСТ 10515-75

ГОСТ 1770-74

Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл

ГОСТ 1770-74

Секундомер

ГОСТ 9586-75

Барометр

ГОСТ 24696-79

Марля медицинская

ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая

ГОСТ 25556- 81

5.2. Реактивы, растворы

Среда сусло-агар: солодовое сусло (значение Баллинга от 5 до 6°) - 98 %, агар-агар - 2 %, рН среды 5,0-6,0, режим стерилизации: Р - 0,8 кгс/см2, 40 мин.

Спирт этиловый ректификат

ГОСТ 5962-67

 Сыворотка или плазма крови человека ( вместо них можно использовать среду 199).

тибиотик биомицин (хлортетрациклина гидрохлорид).

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования:

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88..

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.005-88.и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5 °С), атмосферном давлении 30-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток продуцента воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность среды сусло-агар. Время аспирации воздуха (5- 20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших на 2 сутки после посева проб воздуха по культурально-морфологическим признакам. Метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Агаризованную среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50-60 °С, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха,   чашки Петри помещают в термостат при температуре 37 °С. На 2-е сутки производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

Для постановки дополнительного контроля в среду добавляют сыворотку или плазму крови человека (можно также заменить средой 199) из расчета 0,5 мл сыворотки на 5 мл среды. После отбора проб инкубируют при 37 °С в течение 3 часов. При микроскопировании некоторые дрожжеподобные грибы (С. albicans) в отличие от С. tropicalis на селективной среде образуют ростковые трубки диаметром 3-4 мкм и длиной до 20 мкм (они сходны с мицелием, но не дают сужения в месте прикрепления к дрожжевой клетке).

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м' воздуха производят по формуле:

кл/м3 ,где

Х - концентрация клеток продуцента в воздухе,

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке,

1 000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха,

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол №
количественного микробиологического анализа
штамма-продуцента Candida tropicalis Y-456
в атмосферном воздухе населенных мест

1. Дата проведения анализа______________________

2. Место отбора пробы___________________________

3.Название лаборатории__________________________

4.Юридический адрес организации__________________

Результаты микробиологического анализа

Шифр или № пробы

Определяемый микроорганизм

Концентрация, кл/м3

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Список литературы

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-96. М., 1991. 693 с.

2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ «Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977.7 с.

5. ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ». М.: Изд-во стандартов, 1981. 3 с.

6. Влодавец В. В., Немыря В. И. Санитарно-микологический контроль объектов окружающей среды на предприятиях микробиологической промышленности// Гиг. и сан., 1977. № 1. 25-28 с.

7. Бабьева И. П., Зенова Г. М. Биология почв. М.: МГУ. 122 с.

8. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно патогенных грибов. М.: Мир, 2001. 110 с.

9. Кашкин П. Н., Лисин В. В. Практическое руководство по медицинской микологии. М.: Медицина, 1983. 153 с.

10. Kwon-Chung К . J., Bennett J. E. Medical mycology. Philadelphia: Lea & Febiger, 1992. P. 61-62.

СОДЕРЖАНИЕ

1. Общие положения и область применения . 1

2. Биологическая характеристика Candida tropicalis Y-456 и его гигиенический норматив . 1

3. Пределы измерений . 1

4. Метод измерений . 2

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,   реактивы и материалы .. 2

6. Требования безопасности . 3

Похожие документы