Гми растительного происхождения

ГМ-растения, являющиеся сырьем для получения продуктов питания, по характеру изменений, вносимых в их геном, условно можно разделить на две группы.

В первую группу входят культуры с улучшенными агрономическими свойствами. Они содержат гены устой

чивости к гербицидам (соя, рапс, пшеница и др.)» а также гены почвенной бактерии Bacillus thuringiensis, обеспечивающие защиту растений от насекомых-вредителей (картофель, хлопок, кукуруза, томаты и др.).

Вторая группа объединяет растения, генетическая модификация которых позволила улучшить определенные свойства получаемых из них продуктов: питательные — соя, рапс; технологические — картофель, томаты; орга-нолептические — виноград и ряд других.

Растения, устойчивые к насекомым-вредителям. До недавнего времени для борьбы с насекомыми-вредителями применяли химические инсектициды. Их промышленное производство началось еще в 1940-е годы. В настоящее время рынок инсектицидов огромен. Ежегодно на их производство во всем мире тратится более 4 млрд долл. США. Широкомасштабное применение химических инсектицидов показало, что кроме несомненного эффективного воздействия на насекомых-вредителей они обладают рядом крайне нежелательных для человека свойств:

♦ токсическое воздействие на человека, животных и экосистемы в целом;

♦ длительный срок присутствия в окружающей среде (некоторые инсектициды сохраняются в природе до 20 лет);

♦ постоянное накопление в среде во все возрастающих концентрациях;

♦ биоаккумуляция в тканях многих организмов и передача по пищевым цепям;

♦ неспецифичность действия (наряду с вредителями они уничтожают и полезных насекомых, среди которых имеются их естественные враги);

♦ необходимость многократной обработки растений в течение вегетационного периода;

♦ высокие затраты на производство.

С учетом этого последние 20 лет проводились интенсивные поиски альтернативных способов контроля численности насекомых-вредителей. Целью исследований было выявление природных инсектицидов, синтезируемых различными микроорганизмами и растениями. По

сравнению с химическими инсектицидами природные, как правило, высокоспецифичны и подвергаются быстрой биодеградации. К сожалению, они не очень эффективны, а их получение обходится очень дорого, что ограничивает возможность их широкого применения. Однако если извлечь гены, кодирующие биосинтез природных инсектицидов, и внедрить их в растение, оно само может защитить себя от вредителей. Наиболее перспективной в этом направлении является почвенная бактерия Bacillus thuringiensis, которая вырабатывает токсин белковой природы, губительно действующий на насекомых. Уникальность этой бактерии состоит в том, что разные ее штаммы продуцируют токсины, специфичные в отношении определенных насекомых .

Некоторые штаммы Bacillus thuringiensis и продуцируемые ими токсины

Штамм	Класс токсичности	Насекомые-мишени
Berliner	Cry I	Чешуекрылые
Entomocidus 6.01	Cry I	Чешуекрылые
Kurstaki HD-1	Cry II	Чешуекрылые, двукрылые
Tenebrionis (san diego)	Cry III	— « —
Israelensis	Cry IV	Двукрылые

Например, В. thuringiensis subsp. kurstaki токсичен для личинок чешуекрылых, в том числе моли и бабочек. В. thuringiensis subsp. israelensis уничтожает двукрылых: комаров и мошек. В. thuringiensis subsp. tenebrionis, также известный как san diego, эффективен в отношении жесткокрылых, в том числе колорадского жука и хлопкового долгоносика.

Инсектицид В. thuringiensis находится в бактериальной клетке в виде параспорального кристалла — структуры, которая образуется во время споруляции. Токсин в кристалле находится в неактивной форме, но после заглатывания насекомым он активизируется в кишечнике и под действием специфических пищеварительных про-теиназ превращается в активный токсин. В таком виде он встраивается в мембрану эпителиальных клеток кишечника насекомого и образует ионный канал, через который, как полагают, происходит утечка значительной части клеточного АТФ. Примерно через 15 мин клеточный метаболизм блокируется, насекомое перестает питаться, происходит обезвоживание организма и в конечном итоге наступает смерть .

Для создания растений, устойчивых к насекомым-вредителям, в клетки растения вводят инсектицидный ген В. thuringiensis. Экспрессия такого гена приводит к синтезу в растительной клетке бактериального белкового токсина, и растение становится «несъедобным» для насекомых. Распылять инсектициды в этом случае не требуется, токсины не попадут в окружающую среду, срок действия такой «защиты» длится весь вегетационный период и не зависит от действия внешних факторов (температура, осадки, солнечная радиация). Трансгенное растение должно синтезировать активную форму бактериального токсина в количестве, достаточном для защиты растения от вредителей. Для осуществления этой задачи был сконструирован ген токсина, который содержал лишь последовательность нуклеотидов и кодировал активный токсин (646 N-концевых аминокислотных остатков молекулы протоксина, общая длина которой составляет 1156 аминокислот). Для повышения уровня экспрессии этот ген был снабжен сильным растительным 35S-промотором вируса мозаики цветной капусты. Кроме того, был проведен сайт-специфический мутагенез участков генов токсина, ответственных за эффективность транскрипции или трансляции в растении-хозяине. Трансгенные растения, в которых экспрессировался такой «слабо» модифицированный ген, синтезировали в 10 раз больше токсина, чем

растения, трансформированные геном дикого типа. В дальнейшем была синтезирована химическими методами «полностью» измененная форма гена токсина. Внесенные изменения позволили значительно повысить уровень экспрессии в растении. Так, трансгенные растения, трансформированные сильно измененным геном протоксина, синтезировали в 100 раз больше токсина, чем растения, трансформированные геном дикого типа.

Еще одним способом повышения эффективности синтеза бактериального инсектицидного токсина является внедрение гена в хлоропластную ДНК. Во-первых, ген токсина присутствует в большом числе копий, так как на одну клетку приходится много хлоропластов (в среднем 10—30, но бывает и до 1000), а на один хлоропласт — много копий хлоропластной ДНК (например, в клетках табака — 20 копий ДНК). Во-вторых, нет риска переноса бактериального гена токсина с пыльцой на другие растения, так как хлоропласты в пыльце отсутствуют и передаются только через яйцеклетку, т.е. растения наследуют хлоропластную ДНК по материнской линии.

Таким образом, в настоящее время получены такие устойчивые к насекомым-вредителям трансгенные растения, как томаты, табак, картофель, рис, кукуруза, яблоня, баклажан, рапс, люцерна, орех, хлопок и некоторые другие. Например, созданы и используются в сельскохозяйственном производстве трансгенные растения картофеля, несущие синтетический ген на основе гена инсектицидного токсина В. thuringiensis subsp. tenebrionis, высокоустойчивые к колорадскому жуку — основному вредителю картофеля.

Существуют и другие подходы в создании растений, устойчивых к насекомым-вредителям. Известно, что некоторые растения синтезируют ингибиторы протеиназ, которые, попадая в кишечник насекомого, блокируют гидролиз растительных белков. Если выделить растительный ген ингибитора протеиназ и снабдить его сильным промотором, то можно создать трансгенные сельскохозяйственные культуры, способные синтезировать ингибитор протеиназ в количестве, достаточном для защиты от на

секомых-вредителей. Таким образом были созданы трансгенные растения табака, устойчивые к совке (Heliothis virescens), растения риса, устойчивые к розовому стеблевому точильщику (Sesamia infer ens), основному вредителю этой культуры, растения гороха, устойчивые к зерновке (Callosobrichus maculatus) и долгоносику (C.chinensis).

Растения, устойчивые к гербицидам. Для защиты сельскохозяйственных полей от сорняков и, таким образом, для увеличения урожая применяют специальные химические препараты — гербициды. На их производство во всем мире ежегодно расходуется 10 млрд долл. США. При этом многие гербициды оказывают воздействие не только на сорняки, но и на те растения, для защиты которых их используют. Кроме того, гербициды накапливаются в окружающей среде и представляют определенную угрозу для живых организмов, в том числе и человека. Таким образом, существует проблема защиты хозяйственно ценных культур от неблагоприятного воздействия на них гербицидов. Для ее решения созданы трансгенные растения, обладающие устойчивостью к этим химическим препаратам. Первым таким растением была соя, с которой и началось промышленное внедрение трансгенных растений в сельскохозяйственное производство. Были получены трансгенные растения табака, томатов, картофеля, сои, устойчивые к гербициду глифосату. Глифосат является ингибитором 5-енолпирувилшикомат-З-фосфатсинтетазы (EPSPS) — фермента, играющего важную роль в синтезе ароматических аминокислот у бактерий и растений. Из глифосатустойчивого штамма Е. coli был выделен ген, кодирующий EPSPS, и после создания на его основе специальной генетической конструкции, обеспечивающей экспрессию этого гена, введен в растительные клетки. Трансгенные растения, синтезировавшие EPSPS в количестве, достаточном для замены ингибированного гербицидом растительного фермента, были устойчивы к глифосату, т.е. при обработке им не погибали.

Другой способ приобретения устойчивости — инактивация гербицида. В этом случае создали трансгенные растения хлопка и табака, устойчивые к бромоксинилу — гербициду, который ингибирует фотосинтез. Устойчивые растения создавали путем введения в их геном бактериального гена, кодирующего нитрилазу, которая инактивирует бромоксинил еще до того, как он начинает действовать. Трансгенные растения синтезировали активную нитрилазу и были устойчивы к бромоксинилу.

В настоящее время созданы трансгенные растения, устойчивые к следующим группам гербицидов: триази-ны, имидазолинолы, арилоксифеноксипропионаты, цик-логександионы, глифосаты, бромоксинил, феноксикарбок-сильные кислоты, глюфозинат (фосфинотрицин), цианамид, далапон .

Растения, устойчивые к вирусам. Вирусы растений (фитовирусы) причиняют значительный ущерб растениям и существенно снижают урожай. Известно, что обработка растений генами, кодирующими белки оболочки вируса или антисмысловыми последовательностями вирусной РНК (большинство фитовирусов являютря РНК-содержащими), позволяет получать растения, устойчивые к вирусным инфекциям. Создание трансгенных растений, несущих в своем геноме ген белка оболочки вируса, позволяет значительно ограничить способность вируса проникать в растение и распространяться в нем. Кроме того, обнаружено, что ген белка оболочки одного вируса иногда обеспечивает устойчивость к широкому кругу неродственных вирусов. Поскольку сельскохозяйственные культуры зачастую подвержены нескольким вирусным инфекциям (например, картофель инфицируется вирусом табачной мозаики, Х-, Y-, S-, М-вирусами картофеля, вирусом скручивания листьев картофеля и др.), желательно, чтобы трансгенные растения были устойчивы одновременно к нескольким вирусам. Для этого в растительный геном вводят сразу несколько генов, кодирующих белки оболочки различных вирусов. При этом эффективность защиты растений от вирусной инфекции повышается . В настоящее время получены трансгенные растения, устойчивые к различным вирусам:

Трансгенное растение	Источники генов белка оболочки
Картофель	Вирус скручивания листьев картофеля, Х-, Y-, S-вирусы картофеля
Люцерна	Вирус мозаики люцерны
Огурец	Вирус мозаики огурца
Папайя	Вирус кольцевой пятнистости папайи
Рис	Вирус полосатости риса
Табак	Вирус бронзовости томатов Вирус гравировки табака Вирус мозаики огурца Вирус мозаики сои Вирус погремковости табака Вирус табачной мозаики Х-вирус картофеля
Томаты	Вирус мозаики люцерны Вирус мозаики томатов Вирус табачной мозаики
Тыква	Вирус мозаики арбуза Вирус желтой мозаики кабачков

Растения, противостоящие старению. Серьезной проблемой при транспортировке фруктов и овощей является их преждевременное созревание и размягчение. Установлено, что при созревании плодов в растениях активируются специфические гены, кодирующие ферменты цел-люлазы и полигалактуроназы. Если подавить экспрессию этих генов, то созревание может начаться позже. Известно также, что этилен инициирует экспрессию множества генов, ответственных за созревание и старение плодов. Преждевременное старение плода можно предотвратить, блокируя синтез этилена. Таким образом, замедлить созревание плодов можно ингибированием соответствующих генов .

Для инактивации генов, кодирующих целлюлазу и полигалактуроназу, были созданы трансгенные растения томатов, в которых синтезировались антисмысловые РНК-версии этих генов. При введении таких генов в геном растений томатов количество соответствующей мРНК и активность ферментов уменьшались на 90%. Эти томаты нашли широкое применение в сельскохозяйственном производстве США.

Для подавления синтеза этилена были получены трансгенные растения томатов, синтезирующие антисмысловые мРНК ферментов, необходимые для синтеза этилена. Также в промышленных масштабах выращивается генетически модифицированная мускатная дыня с замедленным созреванием. Таким образом, благодаря снижению синтеза этилена у этих растений его содержание было гораздо ниже, чем в обычных растениях, и они имели более длительный срок хранения.

Изменение пищевой ценности растений. Генетическая модификация растений может изменять качество и повышать урожайность самых разных сельскохозяйственных культур. Причем генно-инженерные технологии позволяют не только ускорить процесс получения растений с улучшенными свойствами, но и создавать сорта с новыми признаками, которые невозможно было бы передать растениям с помощью традиционных методов скрещивания. Уже получены культуры с улучшенными пищевыми качествами (кукуруза, горох), созданы сорта масличных культур с измененным жирнокислотным составом семян, а также сорта плодовых и фруктовых культур с улучшенным вкусом плодов.

Генно-инженерные методы используют для улучшения биологической ценности запасных белков семян. Как правило, в этих белках отсутствуют некоторые незаменимые аминокислоты (обычно лизин или метионин), что делает их биологически неполноценными. Изменив нуклеотидную последовательность генов запасных белков семян, можно синтезировать белок с нужным аминокислотным составом. При крайне низком содержании незаменимых аминокислот в белке увеличить их количество можно путем регуляции биосинтеза. Таким путем были получены трансгенные растения сои и рапса, в семенах которых содержание свободного лизина было в 100 раз, а содержание лизина в составе белков — в 2 раза (у сои) и в 5 раз (у рапса) больше, чем в исходных растениях. В настоящее время подобные работы ведутся с кукурузой, которая, как известно, широко используется не только как пищевой продукт, но и как корм для скота. Обогащение белков кукурузы лизином позволило бы значительно повысить ее биологическую ценность .

Изменение жирнокислотного состава липидов масличных культур. Основными сельскохозяйственными культурами, используемыми для производства масел, являются соя, канола (рапс), пальма и подсолнечник. В состав получаемых из них масел входят главным образом пальмитиновая, стеариновая, олеиновая, линоленовая и линолевая жирные кислоты. Первые две из них являются насыщенными жирными кислотами, остальные три — ненасыщенными. Как известно, наибольшую ценность представляют ненасыщенные жирные кислоты. Так, в оливковом масле содержится преимущественно олеиновая кислота — 82% и лишь незначительные количества пальмитиновой — 9, стеариновой — 2 и линолевой — 4%. Масла некоторых растений содержат специфические жирные кислоты. Например, масла рапса и горчицы включают от 42 до 55% ненасыщенной эруковой кислоты .

С помощью методов генной инженерии можно изменять степень ненасыщенности и длину цепей этих жирных кислот. Было создано и испытано множество трансгенных сортов рапса, которые синтезировали масла с измененным жирнокислотным составом . Каждый трансгенный сорт содержал один дополнительный ген. Например, растения, синтезирующие в большом количестве стеариновую кислоту, содержали в своем геноме антисмысловую копию гена фермента стеаратдесатуразы капусты. В результате экспрессия гена канолы подавлялась и накапливалась стеариновая кислота, которая превращалась в олеиновую. Этот подход позволяет создавать новые сорта масличных культур с заданным набором жирных кислот. Сейчас на рынке имеются различные сорта сои, рапса и других масличных культур с высоким содержанием олеиновой кислоты.

Изменение вкуса. В настоящее время для улучшения вкуса пищевых продуктов добавляют соль, сахар, ароматизаторы, другие пищевые добавки, зачастую искусствен-

Трансгенные сорта канолы (рапса) с измененным жирнокислотным составом семян

Жирная кислота	Содержание жирной кислоты в рапсовом масле (%)	Изготавливаемые продукты
Насыщенные:
стеариновая	40	Маргарин, шоколадное масло
лауриновая	40	Детергенты
лауриновая	60	Детергенты
	40	Детергенты, мыла,
миристиновая		предметы личной гигиены
Ненасыщен
ные:
олеиновая	80	Пищевые продукты, чернила
эруковая	90	Косметика, чернила, фармацевтические препараты, полимеры
петрозелино-	-	Детергенты, полимеры
вая
рицинолеино-	-	Косметика, фармацевти
вая		ческие препараты, пластификаторы, смазочные препараты

Примечание. Прочерк означает отсутствие данных.

ного происхождения. Несомненно, было бы экономически выгодней и безопасней для здоровья человека, если бы исходное сырье непосредственно содержало вещества, придающие будущему продукту необходимый вкус.

В качестве примера можно привести удачные эксперименты по повышению сладости плодов томатов и листьев салата путем введения в геном этих растений синтезированного химическим путем гена монеллина. Монел-лин — белок африканского растения Dioscorephyllum cummincii Diels, в 10000 раз более сладкий, чем сахароза. Этот белок может служить заменителем сахара, к тому же, не являясь углеводом, он имеет более низкую энергетическую ценность. Применение монеллина в качестве подсластителя существенно ограничивается тем, что он является димерным белком, в котором А- и В-цепи соединены между собой слабыми нековалентными связями. В процессе приготовления пищи при нагревании, а также при добавлении лимонной, уксусной или других кислот молекула этого белка диссоциирует на две субъединицы, теряя при этом свои вкусовые качества. Поэтому модификация растений синтетическим геном позволяет обойти эту проблему, поскольку этот ген кодирует А- и В-цепи как один полипептид. Экспрессия синтетического гена в трансгенных растениях томатов и салата приводила к синтезу в них монеллина. Этот белок был обнаружен в зрелых и частично зрелых плодах томата и листьях салата.

Таким образом, эксперименты показали, что этот подход можно использовать для улучшения вкуса плодовых, ягодных и овощных культур.

Другие направления генетической модификации растений. Кроме получения сырья с заданными свойствами генетическая инженерия растений позволяет использовать их как «биореакторы» — организмы, в которых осуществляется суперпродукция тех или иных необходимых для человека веществ.

До недавнего времени в качестве таких «биореакторов» использовались исключительно «рекомбинантные» микроорганизмы, которые синтезировали для человека лекарственные препараты, гормоны, антибиотики и другие со

единения. Сейчас делаются попытки заменить микроорганизмы растениями, которые имеют по сравнению с ними ряд преимуществ. Во-первых, растения имеют значительную биомассу. Во-вторых, культивирование растений, как правило, экономически выгодней и не требует создания специфических производств и привлечения высококвалифицированных специалистов. И, наконец, генетическая модификация растительного генома является достаточно стабильной, в то время как микроорганизмы в процессе длительного культивирования могут утрачивать плазмидную ДНК, в составе которой и находятся необходимые гены.

Уже созданы экспериментальные установки по получению с помощью растений моноклональных антител, функциональных фрагментов антител, а также полимеров (3-гидроксибутирата, из которых можно изготавливать пластик, подверженный биодеградации. В будущем возможно получение с помощью растений различных лекарственных препаратов и материалов, необходимых для хозяйственной деятельности человека.